В ходе войны И-153 получили неожиданную специализацию. Созданные в конце 1941 г. ночные бомбардировочные полки на самолетах У-2, Р-5 и P-Z в течение первой военной зимы показали высокую боевую эффективность. До наступления весны долгие темные ночи были верным союзником этих «небесных тихоходов». Весной и особенно летом ночные бомбардировщики стали нести ощутимые потери от немецких воздушных охотников. Было принято решение для их защиты выделить истребители И-153, которые как нельзя лучше подходили для этой цели.
Одним из первых в ноябре 1941 г. на базе 25-й авиационной школы в городе Невиномыске Ставропольского края был сформирован 654-й ночной легкобомбардировочный авиаполк (НЛБАП). Весной 1942 г. эта часть получила в дополнение к двум десяткам У-2 эскадрилью из восьми И-153, после чего была переименована в 889-й смешанный авиаполк. Летом 1942 г. полк успешно действовал на южном направлении во время боев за Донбасс, затем 25 августа его отвели на переформирование в район Баку. «Чайки» передали в 8-й ИАК, и 889-й полк в течение зимы-весны 1943 г. действовал исключительно на У-2. Летом 1943 г. во время активизации боев в районе Керчи и Новороссийска «Чайки» вернули назад. Теперь их основной задачей стало подавление зенитных средств и уничтожение прожекторов. Подобным образом применялись И-153 авиации Черноморского флота. Активное использование истребителей-бипланов по ночам на этом участке фронта отмечалось в течение всего 1943 г.
В начале 1942 г. советская фронтовая авиация располагала немногим более двумя сотнями И-153. За лето того года из-за боевых потерь и износа материальной части количество таких истребителей сократилось более чем вдвое. По состоянию на 1 июля на фронте насчитывалось 83 «Чайки», из них 42 в 5-й воздушной армии.
Необходимо отметить, что установление точного количества воевавших в тот или иной период И-153 представляется затруднительным, ибо потери частично восполнялись ремонтом и поступлением из тыловых частей, многие подразделения «мигрировали». Так, в начале августа 1942 г. действовавший в полосе 52-й армии в районе Мясного Бора 662-й НЛБАП получил в дополнение к своим У-2 эскадрилью И-153 и И-16. Полк стал именоваться смешанным и действовал в таком составе до весны 1943 г. В апреле его расформировали, а истребители передали другому авиаполку из состава 14-й воздушной армии.
В середине 1943 г. на фронте насчитывалось 36 истребителей И-153. Именно в тот период в частях действующей армии появилась изданная Наркоматом обороны брошюра «Тактика истребительной авиации», разработанная на основе опыта 1941-42 гг. В отношении И-153 она во многом запоздала, но ее положения весьма интересны. Тем более, что пилота И-153 призывали не к обороне, а к активной воздушной схватке(!):
