«Дифракционный барьер установлен где-то в пределах 200–250 нм — рассказал журналистам доктор биологических наук, заведующий лабораторией Института биоорганической химии РАН Константин Лукьянов. — Флуоресцентная микроскопия преодолевает этот предел, достигая разрешения 20–25 нм, то есть на порядок больше. Это позволяет видеть отдельные структуры, причем в живых клетках, где можно увидеть какие-то внутриклеточные процессы».
Технологически это решается двумя разными способами, но если не вдаваться в детали, суть тут такова. Исследователь вносит в клетку флуоресцентную метку, помечая при этом какую-то определенную структуру, какой-то белок или какое-то событие в клетке. Флуоресцентный краситель при этом возбуждается светом и испускает свет другой длины волны. Например, вы светите синим, а флуоресценция у вас зеленая.
Во флуоресцентном микроскопе есть источник возбуждающего света, система фильтров и детектор. В итоге многие процессы, которые раньше было невозможно увидеть, теперь стали видимыми. За это нужно сказать спасибо Стефану Хеллу. В 1993 году, работая в Финляндии, в Университете Турку, он придумал, как усовершенствовать флуоресцентный микроскоп.
Исследователь предложил использовать два лазера, направленных на образец. Импульс первого лазера вызывает флуоресценцию молекул, а импульс второго — гасит ее у молекул, находящихся на краях изучаемой области. В итоге по центру получается изображение с большим разрешением. В дальнейшем, сдвигая изучаемую область, можно увидеть изображение всего объекта с превосходящим предел Аббе разрешением.
Статья Стефана Хелла, опубликованная в 1994 году в журнале Optics Letters, обратила на себя внимание других исследователей. Ему предложили работу в Институте биофизической химии Общества Макса Планка в Геттингене, где он мог бы реализовать свои теоретические предположения на практике.
Ученый сделал это к 1999 году, построив особый микроскоп. Его метод известен сейчас под названием «STED-микроскопия» (Stinulated Emission Depletion — микроскопия на основе подавления спонтанного испускания). В 2000 году он опубликовал изображения бактерии Escherichia coli с невиданным ранее разрешением.
Другое направление независимо от Хелла развивали американские исследователи Эрик Бетциг и Уильям Мернер. Они разработали методы одномолекулярной флуоресцентной микроскопии (single-molecule fluorescence microscopy).
Обычно при изучении флуоресценции, в частности при использовании этого явления в микроскопии, мы имеем дело с поглощением и испусканием излучения сразу множеством молекул. В 1986 году Мернер сумел впервые измерить поглощение излучения одной-единственной молекулой. Через 8 лет он сделал следующий шаг в своих исследованиях, занявшись изучением зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein, GFP). При этом он обнаружил, что флуоресценцию в одном варианте GFP можно «включать» и «выключать» по желанию.
