Новое нападение турок на Родос произошло в 1522 году – весной огромная армия турок под командованием султана Сулеймана Великолепного на четырехстах кораблях высадилась на Родос. 200 000 турок до октября штурмовали крепость, которую защищали триста рыцарей и восемь тысяч пехотинцев. 20 декабря Родос капитулировал на почетных условиях. Турецкая армия при осаде потеряла каждого второго. 180 рыцарей и почти 5 000 родосцев 1 января 1523 года уплыли с Родоса, увезли с собой знамена, пушки, оружие, иконы, мощи, священные сосуды, орденский архив. Император Священной Римской империи Крал V, узнав о турецком нашествии на иоаннитов, сказал: «Ни одна битва не была проиграна так достойно, как битва за Родос». Впоследствии на могиле защитника Родоса великого магистра Вилье де л’Илль – Адама высекли надпись: «Здесь покоится Доблесть – победительница счастья».
24 марта 1530 года император Карл V подписал указ, по которому острова Мальта, Гоццо и Комино, а также стратегический город Триполи на северном побережье Африки передавался Ордену иоаннитов в виде дворянского свободного лена – feudum perpetuum, nobile, liberum, fransum. Лен условно подчинялся вице-королю Сицилии. 25 апреля 1530 года грамоту утвердил римский папа. Верховная власть иоаннитов на Мальте была признана всеми христианскими странами, поддерживавшими с орденом дипломатические отношения.
По договору иоаннитские рыцари должны были охранять от постоянных набегов тунисских пиратов южное побережье Франции и Италии. Орден стал именовать себя «сувереном Мальты». Великий магистр на Мальте имел титул: «Преимущественное Величество». Он являлся правящим государем, ему подчинялись все восемь «языков» – наций. Язык ордена составляли кавалеры Большого Креста, командоры и простые рыцари одного государства, образовывавшие великое приорство того же государства. Каждое приорство было разделено на бальи, или судебные округа, также состоящие из командорств. Судьи – бальи делились на бальи капитулярные, монастырские и по милости. В каждом орденском приорстве была своя казна, деньги в которую собирались в сборных пунктах, располагавшихся на торговых путях, и направлялись в резиденцию ордена.
Флот иоаннитов три раза в год выходил в крейсерское плавание в открытое море из Большой Мальтийской гавани, обычно закрытой железной цепью. Борьба рыцарей с пиратами принесла рыцарскому флоту европейскую славу. Рыцари освобождали тысячи христианских пленников, захватывали сотни пушек и галер. В 1547 и 1551 годах турецкий десант пытался высадиться на Мальте, но был сброшен в море. У входа в гавань Мальты рыцари выстроили форты Сент-Эльмо и Сан-Анжело, форт Сан-Микаэль. Триполи большая турецкая армия все-таки взяла, и его отбить не удалось.
