А некоторое время спустя, в 1691 году, Исаакий, которому тогда исполнился 21 год, с благословения настоятеля Арзамасской обители и своего духовника, поселился вместе с Филаретом на Старом городище. Только месяц прожили они здесь. Не выдержав трудностей пустынножительства, они переселились в Санаксарскую пустынь. Год спустя, по просьбе санаксарской братии, Исаакий в Москве был рукоположен во иеромонаха.
Но даже суровая жизнь Санаксарской пустыни не могла удовлетворить жажду подвига о. Исаакия — он по-прежнему стремился к пустынножительству. В 1692 году вместе с послушником Андреем он вновь переселился в Темниковские леса, на Старое городище. Вскоре он остался там совсем один — послушник, не выдержав тягот пустынножительства, вернулся в Санаксары.
В одиночестве о. Исаакия постигли тяжкие искушения: и душевные и телесные — тяжко заболев, он уже готовился к смерти. Но тут о нем вспомнила Санаксарская братия, которая в то время осталась без иеромонахов. Они упросили о. Исаакия на время переселиться к ним для служения литургии. Около года прожил о. Исаакий в Санаксарской обители; за это время он полностью поправился, и с новыми силами возвратился в пустыню.
Однажды в его уединение забрел соловецкий монах Николай. Он посоветовал о. Исаакию построить церковь на Старом городище. Поначалу этот совет казался неосуществимым. Но затем о. Исаакий получил подтверждение, что на строительство здесь храма есть воля Божия. Тем паче, что в окрестных селениях и лесах процветал раскол.
В 1700 году о. Исаакий начал собеседования с раскольниками. Иногда они приглашали его в свои скиты для прений о вере. В результате многие раскольники вернулись в Православие. Именно они и стали первыми насельниками будущей Саровской обители.
Труды иеромонаха Исаакия стали широко известны — в результате, с благословения священноначалия, братия арзамасской Введенской обители избрала его своим настоятелем. Согласившись принять на себя управление городской обителью, о. Исаакий намеревался через некоторое время возвратиться к пустынножительству. Переселившись в Арзамас, он по-прежнему навещал пустынножителей и наставлял их в вере. Но не всем это пришлось по душе. Иеромонах Варлаам позавидовал влиянию о. Исаакия и написал на него донос, в котором обвинял наставника в расколоучительстве. В результате в 1703 году настоятель Введенской обители был вызван в Москву.
После разбирательства, окончившегося полным оправданием о. Исаакия, он, возвратившись в Арзамас, поставил вместо себя настоятелем Введенской обители своего ученика Афиногена и удалился в Саровскую пустынь.
