Конечно, приход немногочисленного отряда имел больше моральное значение, но ненамного изменил тяжелое положение защитников крепости. От болезней, беспрестанных стычек с противником за время осады в монастыре погибло 2125 человек. К весне в рядах защитников насчитывалось не более 500 человек, способных держать оружие. Да и голод оказывал свое страшное воздействие на боеспособность и стойкость осажденных. Между монахами и ратниками наметились разногласия. Ратные люди упрекали монахов, что те отдельно питались в своих кельях.
В конце марта 1609 г. дочь Бориса Годунова, монахиня Ольга, бывшая в том монастыре, писала своей тетке: «Я в своих бедах чуть жива и, конечно, больна со всеми старцами, и вперед не чаем себе живота (жизни), с часу на час ожидаем смерти, потому что у нас в осаде шатость и измена великая. Да у нас же за грехи наши моровое поветрие; великие смертные скорби объяли всех людей; на всякий день хоронят мертвых человек по двадцать, по тридцать и побольше, а те, которые еще собою не владеют: все обезножили».
С наступлением весны защитники несколько приободрились — стали выводить ослабевших на свежий воздух, искали коренья трав для лечения больных. Но противник, зная о тяжелом состоянии троицкого гарнизона, начал деятельную подготовку к первому в 1609 г. общему штурму. Дозорные с башен заметили необычное оживление в стане врага. Там восстанавливали батареи, ремонтировали осадные подкатные башни. Воеводы приказали осажденным повысить бдительность и приготовиться к отражению штурма.
27 мая целый день в станах осаждавших стоял большой шум, звучала музыка. Снова скакали всадники вокруг монастыря, грозя мечами ратникам. Но к вечеру все стихло. Толпы всадников скрылись за лагерными укреплениями. Но это была обманчивая тишина.
Когда стемнело, вражеское войско молча двинулось к городским стенам: «Ползли они молча, словно змеи по земле: везли орудия для приступа: щиты рубленые, лестницы, туры и стенобитные машины. Все городские люди, мужчины и женщины, вышли на городские стены и также скрытно ждали приступа. С Красной горы сверху загремели выстрелы из пушек, закричало все множество литовских людей и русских изменников и устремилось со всех сторон к городу с лестницами, щитами, тарасами на колесах и разными стенобитными орудиями».
После выстрелов по монастырю в стане противника взыграла музыка, и он дружно с двух сторон ринулся на приступ. Но осажденные встретили польско-литовских захватчиков во всеоружии: «Христолюбивое же воинство и все люди городские не давали им щитов и Тарасов подвинуть, и лестницу прислонить, били из подошвенного боя из многих пушек и пищалей, а в бойницы кололи, и камни метали, и кипяток лили; и серу и смолу зажигали и метали, и известью засыпали скверные их очеса, и так бились всю ночь».
