Святой Митрофан был вызван в столицу и 2 апреля 1682 года посвящен во епископа Воронежского Патриархом Иоакимом и шестнадцатью архипастырями. Начало епископского служения святителя Митрофана совпало с тяжким для Руси временем смут и церковного раскола. По прибытии в Воронеж святитель прежде всего разослал пастырям своей епархии Окружное послание, в котором призывал своих пасомых к нравственному исправлению. «Честные иереи Бога Вышняго! — писал святитель. — Вожди стада Христова! Вы должны иметь светлые умные очи, просвещенные светом разумения, чтобы вести других по правому пути. По слову Господа, вы должны быть самым светом: вы есте свет мира (Мф. 5, 14)… Христос Спаситель, вручая паству апостолу Своему, трижды сказал ему: паси, — как бы внушая тем, что три есть различные образа пасения: слово учения, молитва при пособии Святых Таин и пример жизни. Действуйте и вы всеми тремя способами: подавайте пример доброй жизни, учите людей своих и молитесь о них, укрепляя их Святыми Тайнами; наипаче же неверных просвещайте Святым Крещением, а согрешивших приводите к покаянию. Будьте внимательны к болящим, чтобы не отошли от сей жизни без Причащения Святых Тайн и помазания святым елеем».
Святитель Митрофан начал архипастырскую деятельность с постройки нового кафедрального собора в честь Благовещения Пресвятой Богородицы взамен ветхого деревянного храма. В 1692 году собор с приделами во имя Архистратига Михаила и святителя Николая был освящен. Во время 20-летнего святительства святителя Митрофана количество храмов в епархии возросло со 182 до 239, было основано 2 монастыря: Вознесенский Коротоякский и Троицкий Битюгский. В существовавших монастырях он заботился об искоренении нестроений и беспорядков и утверждении строгой жизни по иноческому уставу.
Первый воронежский святитель ревностно заботился о нуждах паствы. Он утешал бедных и богатых, был покровителем вдов и сирот, заступником обиженных. Его дом служил гостиницей для странников и лечебницей для больных. Молился святитель не только о живых, но и об усопших христианах, и особенно о воинах, павших за Отечество, вписывая их имена в синодик. Поминая их за проскомидией, святитель Митрофан говорил: «Аще праведна душа, то большей части сподоблена бывает, аще ли грешна, то будет причастница милости Божией».
Святитель Митрофан как человек высокого патриотизма своим нравственным авторитетом, милосердием и молитвами содействовал преобразованиям Петра I, необходимость и цель которых хорошо понимал. При постройке в Воронеже флота для похода на Азов святитель Митрофан убеждал народ всемерно помогать Петру I. Это было особенно важно, ибо многие считали устройство флота делом бесполезным. Святитель не ограничивался только советами царю, но оказывал и материальную поддержку государственной казне, нуждавшейся в деньгах для строительства флота, и отдавал все свои средства, сознавая, что они идут на благо Родины.
