Война в Ливонии продолжалась, не принося, однако уже таких громких успехов, как в первые месяцы схватки за Прибалтику. Во многом это было обусловлено вступлением в войну более сильного, нежели Ливонский орден, противника – Великого княжества Литовского. Первые столкновения между русскими и литовскими отрядами в Ливонии начались уже летом 1560 г. За кулисами этих военных столкновений велись дипломатические переговоры между властями Ливонии и Великого княжества Литовского. 18 ноября 1561 г. Ливонский орден исчез с карты Европы: в этот день в столице Великого княжества Литовского Вильно между королем Сигизмундом II Августом и ландмейстером Ливонии Готхардом Кетлером было подписано соглашение, по которому часть земель ордена – Курляндия и Земгалия – были провозглашены герцогством Курляндским. Герцогом новоявленного государства стал Кетлер, признавший себя вассалом польской короны. Остальные ливонские земли – Эстляндия и Лифляндия – были включены в состав Великого княжества Литовского.
Летом 1562 г. князь Андрей Курбский, назначенный воеводой в Дерпт, совершил глубокий рейд вглубь литовских земель, разорив окрестности Витебска. Но уже в августе 1562 г. под Невелем он потерпел поражение (которое, впрочем, не было поставлено Иваном Грозным ему в вину). После этого царь решил лично выступить в поход против Великого княжества Литовского. В конце ноября 1562 г. его войско (в котором по некоторым оценкам было до 60 тыс. человек) выступило из Москвы и двинулось в направлении ключевой литовской крепости на Западной Двине – Полоцка. 31 января 1563 г. город был осажден. Несколько предложений о капитуляции литовский воевода Станислав Довойна с гордостью отверг. Но уже через две недели, 15 февраля, город был взят штурмом. В плен попало около 60 тысяч жителей города, изрядная часть которых была в дальнейшем продана в рабство. Захваченным в городе евреям было предложено креститься; тех из них, кто отказался это сделать, утопили в Двине. Взятие Полоцка открывало дорогу на столицу Великого княжества Литовского, Вильно, поэтому уже через неделю после «полоцкого взятья» в стан Ивана IV явились литовские послы с просьбой о перемирии (на которую царь ответил согласием).
Иван Васильевич был охвачен эйфорией вследствие своей, бесспорно, большой победы. Он тут же распорядился присоединить к своему титулу слова «и великий князь Полоцкий». Воодушевленный победой, он написал язвительное послание еще одному своему сопернику в Ливонии – королю Эрику XIV, «а писал к королю многие бранные и подсмеятельные слова на укоризну его безумию». Шведские власти вынуждены были терпеть эти оскорбления, поскольку в том же году против Швеции открыла боевые действия Дания (с которой незадолго до выступления в Полоцкий поход Иван Грозный заключил союз, признав права датского принца Магнуса на остров Эзель).
