После пожара 1501 года древний собор пришел в негодность. Для сооружения нового храма по указу великого князя Василия III были присланы московские мастера, закончившие строительство к 1516 году.
Спасо-Преображенский собор представляет собой стройное здание на высоком подклете, увенчанное тремя шлемовидными главами, с открытой галереей на западном фасаде. В его облике заметно влияние построек Московского Кремля конца XV – начала XVI веков. В интерьере храма сохранились росписи 1563-1564 годов множества работ московских и ярославских мастеров. Исследователи отмечают богатство сюжетов и мастерство исполнения. Особым разнообразием и изяществом рисунка отличаются орнаменты "полотенец" в нижнем ярусе росписей, напоминающие гравюру на металле.
Одновременно со строительством Спасо-Преображенского собора возводились укрепления монастыря. От первоначальной крепости сохранились Святые ворота на южной стене (1516 год, с позднейшими перестройками), служившие в древности главным въездом в монастырь. Это сложное сооружение, включало крепостную башню с двумя проездами и укрепленным двориком (почти полностью разобран в XVIII веке), надвратную церковь и дозорную башню-часозвонню, которая была надстроена в 1620-х годах. В 1564 году своды проездных арок были расписаны фресками на тему Апокалипсиса. По остаткам живописи, таким, как фигуры трубящих ангелов, можно догадываться о ее былом великолепии.
Современна собору и трапезная. Это одно из наиболее монументальных сооружений такого рода в русском зодчестве первой половины XVI века. Мощь постройки подчеркивают широкие лопатки, членящие стены, и окна, углубленные в тройные ниши. Внутри своды опираются на мощные столбы (своды второго этажа восстановлены в 1950-х годах).
В конце XVI века с запада к трапезной было пристроено здание Настоятельских покоев, богато украшенное наличниками и сложным профилированным карнизом. Видимо, тогда же, судя по рисунку наличников, была сооружена или перестроена Рождественская церковь при трапезной. Верхний этаж церкви искажен переделками XIX века. В XVI столетии была построена и первоначальная звонница, частично вошедшая в постройку XVII века, на восточном фасаде которой хорошо видны следы кокошников, завершавших древнее здание.
В событиях Смутного времени начала XVII века Спасский монастырь с его каменной крепостью был одним из главных узлов обороны города. В XVII веке стены и башни были обновлены и перестроены. В 1623 году была сооружена северо-западная Богородская башня, в 1635-м – северо-восточная Угличская, служившая одновременно и городскими воротами. Несмотря на сравнительно небольшую высоту, эти квадратные башни, снабженные четырьмя рядами бойниц и увенчанные остроконечными шатрами, придают монастырю вид настоящей крепости.
