Осенью 1937 г. в Китае И-16 встретились в воздушных боях с японскими истребителями-монопланами А5М (И-96), а в 1939 г. на-Халхин-Голе — с Ки-27 (И-97). Эти машины, в которых конструкторы стремились совместить качества скоростного и маневренного истребителей, имели неубирающееся шасси, малую удельную нагрузку на крыло, высокую маневренность, были просты в технике пилотирования. И-16 превосходил И-97 по боевой живучести, обладал более прочной конструкцией, лучшими пикирующими свойствами, до высоты 5 км имел превосходство в скорости и скороподъемности, но уступал в маневренности. В целом японские самолеты оказались серьезными противниками.
К 1941 г, И-16 окончательно устарел, но именно ему пришлось вынести основную тяжесть воздушных боев начального периода Великой Отечественной войны. Хорошо освоенные летным и техническим составом, И-16, особенно с пушечным вооружением, в опытных руках были достаточно грозным оружием. Именно на них многие известные летчики одержали свои первые победы. На этих машинах воевал и истребительный авиаполк, ставший первым Гвардейским. По статистике командования ВВС, летом 1942 г. чисто боевые потери на один самолето-вылет на И-16 были даже несколько ниже, чем на Як-1. Но ввиду изношенности матчасти на И-16 было много потерь во внебоевой обстановке. Поэтому в порядке возрастания потерь самолеты располагались так: Як-1, И-16, МиГ-3, И-153, ЛаГГ-3 и т. д.
О боевом применении "ишаков", которые состояли на вооружении вплоть до 1943 г., рассказывают многие книги и статьи, Редко какое историческое исследование, посвященное Великой Отечественной войне и ей предшествующим конфликтам, обошлось без хотя бы упоминания об этом знаменитом истребителе.
Из многочисленных экспериментальных вариантов И-16 следует отметить такие. ЦКБ-18 — штурмовик с бронированной кабиной и мотором М-22. Вооружение — четыре пулемета ШКАС в крыле и 100 кг бомб. И-16 тип 20 был построен для испытания подвесных баков. На И-16 с. о… И-16 БС отрабатывалась установка синхронных крупнокалиберных пулеметов БС, ТКБ-150, а на И-16 ПС — синхронных пушек ШВАК.
На отдельных типах И-16 для повышения высотности двигателя предпринимались попытки установить турбокомпрессоры. С двумя ТК-1 и мотором М-25В И-16 показал скорость 494 км/ч на высоте 8600 м, а с М-62 — 520 км/ч на высоте 10000 м. Это самая большая скорость, реально полученная на И-16. К сожалению, довести турбокомпрессоры до рабочего состояния удалось только в 1947 г. на АШ-73ТК, с использованием американского опыта (на бомбардировщике Ту-4).
