Мария, ласкаемая Мазепой, еще не знает об ужасной судьбе отца, и Мазепа содрогается от мысли, что будет с ней, когда все откроется. Он раскаивается, что прельстил ее, что попытался впрячь в одну телегу «коня и трепетную лань». Оставя сидящую в неведенье Марию, мучимый сомнениями, Мазепа выходит из дворца.
На рассвете в покой, где спала Мария, прокралась ее мать и открыла дочери страшную весть. Мать не может поверить, что дочери ничего не известно, она просит Марию пасть к ногам Мазепы и умолить его пощадить отца. Не в силах перенести душевные муки, Мария лишается чувств.На месте казни собралась огромная толпа. На телеге привезли осужденных Кочубея и Искру. Мученики всходят на плаху, палач рубит им головы и, держа за чубы, показывает толпе. Когда место казни уже опустело, прибегают две женщины, но, увы, они опоздали.
Вернувшись домой после ужасной казни, Мазепа находит светлицу Марии пустой. Он отправляет казаков на поиски, но все тщетно: никто нигде не видал Марию.
Душевная печаль не мешает гетману осуществлять свои политические замыслы. Продолжая сношения со шведским королем, Мазепа притворяется смертельно больным, но проворно встает со смертного одра, когда Карл переносит военные действия на Украину. Теперь Мазепа ведет полки против Петра. Петр сам ведет дружины к Полтаве, и вот две армии стали друг против друга, готовые к утреннему сражению. Ночью перед сражением Мазепа беседует с Орликом и говорит о своем разочаровании в Карле, который не кажется ему государственным мужем, могущим тягаться с самодержавным великаном. Орлик отвечает, что еще не поздно перейти на сторону Петра, но Мазепа отвергает это предложение и открывает причину своей ненависти к русскому царю. Когда-то на пиру в ответ на смело сказанное слово Петр схватил Мазепу за усы. За это оскорбление и поклялся отомстить Петру Мазепа.
Утром начинается Полтавское сражение, в котором боевое счастье служит русским войскам. Воодушевленные появлением Петра, русские полки теснят шведов. Мазепа молча наблюдает за битвой, и вдруг позади него раздается выстрел. Это Войнаровский сразил мчавшегося с саблей на Мазепу молодого казака, который, умирая, прошептал имя Марии.
Закончилась битва, пирует в своем шатре Петр «и за учителей своих/Заздравный кубок подымает», но нет среди пирующих Карла и Мазепы. Они скачут верхом, спасаясь от преследования. Внезапно хутор, мимо которого мчатся беглецы, пугает Мазепу: он узнает место, где некогда пировал и откуда вывел темной ночью в степь Марию. Беглецы ночуют в степи на берегу Днепра, как вдруг кто-то окликает Мазепу в ночной тиши. Он открывает глаза и видит Марию. Она в рубище, с распущенными волосами, сверкающими впалыми глазами. Мария лишилась рассудка. Она не узнает Мазепу, говорит,что это кто-то другой, и скрывается в ночной темноте. Утром Карл и Мазепа скачут далее.
