Такой человек нашелся среди полтавских казаков, когда-то отвергнутый Марией, но по-прежнему любящий ее даже в ее позоре и ненавидящий ее соблазнителя. Он отправляется в путь с зашитым в шапке доносом Кочубея на изменника-гетмана. Мазепа же, не подозревающий о страшной опасности, плетет политическую интригу, ведя переговоры с посланником иезуитов, возмущая казаков на Дону, поднимая против Москвы Крым, Польшу и Турцию. И вот посреди этих коварных забот русские вельможи переслали ему донос на него, писанный в Полтаве и оставленный Петром без внимания. Оправдываясь перед Петром и убеждая его в своей верности, Мазепа требует казни доносчиков, казни отца своей возлюбленной, «...но дочери любовь главы отцовской не искупит». Мария же самозабвенно любит Мазепу и презирает молву. Лишь иногда ею овладевает печаль при мысли о родителях. Но она не знает еще того, что знает уже вся Украина, страшная тайна от нее скрыта.Мазепа мрачен, и «ум его/Смущен жестокими мечтами». Даже ласки Марии не в состоянии развеять его страшные мысли, он остается холоден к ним. Оскорбленная Мария укоряет его, говоря, что ради него сгубила собственное счастье, опозорила себя. Мазепа пытается успокоить Марию словами любви, но она обвиняет его в хитрости и притворстве. Она даже ревнует его к некой Дульской. Мария хочет знать причину Мазепиной холодности. И Мазепа открывает ей свои замыслы восстания Украины против владычества Москвы. Мария в восторге и жаждет видеть возлюбленного с царским венцом на голове. Она сохранит ему верность и в несчастье и даже пойдет с ним на плаху. И Мазепа подвергает Марию страшному испытанию: он спрашивает, кто ей дороже – отец или супруг? Он старается принудить ее к однозначному ответу, ставит ее перед ужасным выбором: чью гибель она предпочтет, если ей будет суждено выбирать, кого отправить на казнь. И желанный ответ получен.
«Тиха украинская ночь». В старом замке в Белой Церкви сидит в башне окованный Кочубей и ждет казни, которой не боится – его гнетет позор, потеря чести. Он отдан царем на поругание врагу, не имея возможности никому завещать свою месть обидчику. Открывается дверь его темницы, и входит кровожадный Орлик. Мазепе известно, что Кочубей спрятал сокровища, и Орлик пришел узнать, где они таятся. Кочубей отвечает, что его сокровищами были его честь, честь дочери, но эти сокровища отняты пыткой и Мазепой, а третий клад – святую месть – он готовится снести Богу, Орлик допытывается, где спрятаны деньги, но безуспешно, и Кочубея отдают в руки палачу.
