Эта увлекательная химия | страница 43
Каким же образом ученые узнают последовательность аминокислот в том или ином белке? Сразу же заметим, что расшифровка структуры даже относительно простого белка — дело очень трудоемкое и требует многих месяцев, а иногда и лет упорной работы.
Многие белковые молекулы состоят из двух или больше полипептидных цепей, связанных между собой в нескольких местах. Прежде всего надо разделить цепи. Но в каждой цепи есть N-концевая аминокислота; следовательно, узнав, сколько N-концевых аминокислот в данном белке, мы будем знать и число цепей. Для такого определения существуют специальные методы. Вот один из них — динитрофенилирование. Используют 2,4-динитрофторбензол, который реагирует только со свободными аминогруппами белка, образуя производное. После этого белок гидролизуют, т. е. расщепляют кислотой по амидным связям. Получают свободные аминокислоты и динитрофенильные производные концевых аминокислот. Выделяя из этих производных свободные аминокислоты, узнают, какие именно аминокислоты образуют N-концевые группы полипептидных цепей и сколько этих цепей в белке.
Сэнгер, который исследовал описанным методом инсулин, обнаружил, что на одну молекулу белка приходилась одна молекула N-концевого глицина и одна молекула N-концевого фенилаланина. Отсюда был сделан вывод, что молекула инсулина состоит из двух цепей (цепи А и В).
Метод Сэнгера позволяет определить, какие кислоты находятся в белке на N-конце. Но как узнать расположение других аминокислот? Для этого существуют другие методы, один из них предложен Эдманом. Аминокислоты последовательно отщепляют, начиная с N-конца, для чего проводят реакцию с фенилизотиоцианатом. Образуется циклический продукт. При этом обнажается следующая аминокислота, с которой поступают аналогичным образом. Вот так, "отщепляя" аминокислоты одну за другой, узнают первичную структуру полипептидов:
Однако исследователи не отщепляют по методу Эдмана аминокислоты от целой белковой цепи. Перед анализом длиннейшую цепь расщепляют при помощи ферментов на отдельные полипептидные куски, после чего определяют последовательность аминокислот в каждом куске и, наконец, составляют так называемую карту с перекрывающимися аминокислотными остатками.
Предположим, что мы имеем фрагмент белковой молекулы — пептид, состоящий из десяти разных аминокислот (мы сильно упрощаем реальную картину: в белках сотни аминокислот, причем каждая встречается много раз). Расщепив этот пептид на части и определив последовательности аминокислот в каждой из них, мы получим такую картину:
