Двадцать второго сентября 1929 года была создана Чешская православная епархия (в юрисдикции сербской церкви) с административным центром в Праге. Руководящие органы епархии считали открытие в столице православного кафедрального собора своей первоочередной задачей. Сначала городские власти хотели отдать православной общине храм Святого Иоанна Предтечи на Прадле, но впоследствии изменили свое решение. С июня 1932 года Епархиальный совет вынужден был отказаться от дальнейших попыток приобрести храм Святого Иоанна и стал добиваться передачи в свое пользование костела Святого Карла Боромейского на Рессловой улице.
Заинтересованность в этом деле проявил и МИД ЧСР. Тридцать первого октября 1932 года заместитель министра иностранных дел Чехословакии Камил Крофта направил письмо министру общественных дел Яну Досталеку, в котором сообщал, что положение православной церкви в Чехословацкой республике вызывает живой интерес внешнеполитического ведомства. Поскольку Государственное управление культов стремится к автокефалии православной церкви в Чехословакии, то вопрос о наличии в Праге чешского православного храма имеет принципиальное значение. Доктор Крофта просил Министерство общественных дел способствовать передаче храма Святого Карла Боромейского в распоряжение православной церкви.
Двадцать девятого июля 1933 года чехословацкое правительство приняло постановление о передаче костела в распоряжение Чешской православной епархии. Новые владельцы должны были не только восстановить первоначальное убранство храма, но и приспособить его для нужд православной церкви. После расчистки и реставрации фресок в храме был установлен иконостас, созданный югославским художником Святославом Вуковичем по проекту профессора В. А. Брандта. Иконы для собора были написаны М. В. Васнецовым и отцом Всеволодом Коломацким. В крипте под храмом было оборудовано 75 мест для будущих захоронений православных священнослужителей.
Двадцать восьмого сентября 1935 года, в день памяти святого Вацлава Чешского, отремонтированный храм был торжественно освящен в честь святых равноапостольных братьев Кирилла и Мефодия и стал кафедральным собором Чешской епархии. Вместе с тем он выполнял функции приходского храма Чешской православной общины в Праге.
В 1939 году Чехословацкая республика прекратила свое существование. Чешские земли были оккупированы немецкими войсками. Шестнадцатого марта по указу Гитлера здесь был создан Имперский протекторат Богемия и Моравия.
