В 1792 году вышла из печати его крупная работа «Афоризмы из химической физиологии растений», а год спустя «Флора Фрейберга». Работы эти получили высокую оценку в научных кругах различных стран.
Некоторые выводы Гумбольдта значительно опережали научную мысль того времени и были подтверждены много лет спустя. Так, например, обнаруженные в растениях минеральные соли в то время считали случайной примесью. Гумбольдт доказал, что они являются необходимыми составными элементами пищи растений. Только после работ химиков Соссюра в Либиха мнение это утвердилось в науке.
В 1792 году Гумбольдт ознакомился с открытием итальянского физика Луиджи Гальвани о животном электричестве и с работами другого итальянского физика — Александра Вольта, который отвергал существование животного электричества.
Гумбольдт решил опытным путем проверить противоречивые выводы этих ученых и дать свое заключение. Он с большим самоотвержением начал экспериментировать на своем теле. На его спине врачом делались раны и гальванизировались различными способами. Своими экспериментами Гумбольдт подтвердил выводы Гальвани и высказал мнение, что возникновение электрических токов в теле животных вызывается нервной деятельностью. Только через 50 лет этот вывод был подтвержден французским ученым Дюбуа-Реймоном.
Результатом этих исследований явилось двухтомное сочинение «Опыты над раздраженными мускульными и нервными волокнами», напечатанное в 1797–1799 годах. Это сочинение произвело сенсацию в ученом мире. Гумбольдта стали считать основоположником физиологии нервной деятельности.
Геология, ботаника, физиология растений, химия, физика, наблюдения и эксперименты — все это в его трудах тесно связывалось между собой. Он вел переписку и полемику, из всех стран мира приходили к нему книги и статьи.
14 ноября 1796 года умерла мать Гумбольдта, которая не хотела отпускать его в путешествие. После похорон матери Гумбольдт сразу же вышел в отставку и решил в будущем жить исключительно для науки.
В том же году он поехал к брату Вильгельму в Иену, чтобы решить вопрос о разделе наследства. Здесь он близко познакомился с Шиллером и Гёте; последний в эти годы увлекался естествознанием. Гёте был в восторге от Гумбольдта. Они вместе слушали в университете лекции профессора анатомии Лодера, обсуждали проблемы геологии, физики, занимались экспериментами по физиологии растений. В письме к герцогу Веймарскому Гёте писал о Гумбольдте: «Он настоящий рог изобилия в отношении наук».
