Неудачный оборот для российской внешней политики приобрели и события в Польско-Литовском государстве. Еще в январе 1569 г. в городе Люблине начал работу сейм, который к июлю утвердил унию (союз) между Польским королевством и Великим княжеством Литовским. Ранее они были объединены лишь общей для них персоной государя из династии Ягеллонов. В случае пресечения династии (а у последнего Ягеллона, Сигизмунда II Августа, по-прежнему не было детей) уния между Польшей и Литвой могла быть расторгнута. В этом случае Иван Грозный, бывший (в четвертом колене) единственным потомком великого князя литовского Витовта, мог бы претендовать на престол Великого княжества Литовского. Однако и эта возможность не была реализована: Люблинская уния 1569 г. окончательно объединила Польшу и Литву в одно федеративное государство – Речь Посполитую (от польского «Rzechpospolita» – республика). Впрочем, это не помешало Ивану Грозному спустя 4 года, в 1573 г., заключить с германским императором Максимилианом II Габсбургом договор о совместных действиях против Речи Посполитой, в результате которых польские земли должны были достаться императору, а литовские, ливонские, украинские и белорусские – царю.
Угрожающий характер приобретали события на южных рубежах. Крымский хан Девлет-Гирей задержал присланного к нему в 1563 г. русского посланника Афанасия Нагого и возобновил набеги на русские земли. Турецкий султан Селим II (сын Сулеймана Великолепного и Роксоланы) весной 1569 г. отправил в Азов в устье Дона 17-тысячную армию при ста орудиях. Соединившись с 40-тысячной ордой крымского хана, турецкое войско двинулось на Астрахань. Попытка прорыть канал между Доном и Волгой успехом не увенчалась, поэтому пушки пришлось отправить обратно в Азов. Подступив в сентябре 1569 г. к Астрахани, турки и татары вскоре были вынуждены отступить (тем более что в их тылах действовала пришедшая Волгой русская «плавная рать» под командой воеводы князя Петра Серебряного-Оболенского).
В условиях военно-политических осложнений на всех направлениях подозрительность царя обострялась. Последней каплей стала кончина царицы Марии Темрюковны, умершей в сентябре 1569 г. Иван Грозный вновь подумал о возможности отравления, и его подозрения пали на семью Старицких. По приказу Ивана Васильевича в октябре 1569 г. была умерщвлена княгиня Ефросинья Старицкая (ее и еще несколько монахинь отравили угарным газом). Затем государь потребовал к себе в Александрову слободу брата, Владимира Андреевича. Так и не дождавшись его приезда, Иван Васильевич сам выехал ему навстречу и заставил выпить отравленное вино (предупредив при этом князя Старицкого, что напиток отравлен – этим он превращал убийство соперника в самоубийство). Судьбу князя Владимира Андреевича разделили его супруга и старшая дочь.
