К XVI веку монастырь сделался одним из крупнейших вотчинников Московского государства, уступая из монастырей лишь Троице-Сергиеву. По данным 1601 года, ему принадлежало 11 сел, 5 селец, 607 деревень и 320 пустошей. Такой быстрый рост монастыря оказался возможен благодаря активной поддержке московских великих князей, выражавшейся во всевозможных льготах, земельных пожертвованиях и денежных вкладах, в пожаловании соляных промыслов и рыбных ловель.
Монастырь, со своей стороны, оставался верным союзником старейшей линии рода московских князей в кровавой борьбе за московский престол, которая развернулась в середине XV века при внуках Дмитрия Донского. В 1447 году в монастырь приехал московский великий князь Василий II Темный, незадолго до того захваченный своим соперником Дмитрием Шемякой, ослепленный им и сосланный в Вологду. Кирилловский игумен Трифон торжественно освободил Василия II от данного им "крестного целования" не "искать" вновь московского престола. Официальная поддержка церкви имела для великого князя большое значение в решающий момент борьбы за московское княжение.
В конце XV - начале XVI веков с Кирилловым и другими заволжскими монастырями тесно связана группировка сторонников монастырского "нестяжания" (отказа от владениями селами), полагавшая, что иноки, посвятившие себя Богу, не должны пользоваться трудом чужих рук и "кормиться" собственным "рукоделием". На церковном соборе 1503 года нестяжатели потерпели поражение, однако ожесточенная борьба между враждующими партиями внутри русской церкви вокруг вопроса о монастырском землевладении еще долго не ослабевала. Хотя Кириллов монастырь, обладавший огромным вотчинным хозяйством, никогда не проводил на практике идей нестяжания, из него вышли и в нем подвизались многие крупнейшие деятели этого движения. Среди них - глава первых нестяжателей Нил Сорский, постриженик Кирилло-Белозерского монастыря. После пребывания на Афоне, где он приобрел обширные богословские звания, Нил возвратился в Белозерье и основал свой скит посреди непроходимых лесных болот, в 20 км к северу от Кириллова. Влияние проповеди Нила Сорского, видевшего в монашестве прежде всего подвиг личного нравственного совершенствования, было особенно велико среди братии северных монастырей. Один из видных нестяжателей, Гурий Тушин, некоторое время был игуменом Кирилло-Белозерского монастыря. Монастырь в ХV-ХVI веках пользовался большим влиянием, а его настоятель входил в число высших церковных иерархов.
