Вскоре Мария Стюарт осознала, что лорд Дарнли морально оказался не готов к королевскому титулу, что она вышла замуж за человека без особых талантов и достоинств. Королева, поняв свою ошибку, стала пренебрегать своим супругом. Стала очевидной ее симпатия к Джеймсу Хепберну, графу Ботвеллу, который резко контрастировал с Дарнли своей силой, мужественностью и решительностью. Разрыв королевы и короля становится свершившимся фактом: Дарнли даже отказывается присутствовать на крещении их ребенка, будущего короля Якова VI, родившегося 19 июня 1566 г. 10 февраля 1567 г. при таинственных обстоятельствах взорвался дом в Керк-о’Фильде, пригороде Эдинбурга, где остановился Дарнли, а сам он был найден убитым во дворе, видимо, заколотый при попытке бегства из горящего дома. Кто бы ни был действительным убийцей Дарнли, по крайней мере, косвенную вину в этом преступлении общественное мнение Шотландии возложило на королеву как неверную жену. Мария Стюарт не сделала ничего, чтобы доказать свою невиновность. Наоборот, уже 15 мая 1567 г. в Холируде состоялось бракосочетание Марии и графа Ботвелла. Этот брак с вероятным убийцей короля немедленно лишил Марию Стюарт всякой поддержки в стране, чем немедленно воспользовались лорды-протестанты, собравшие значительные военные силы. Они выбили королеву и Ботвелла из Эдинбурга. Мария Стюарт была вынуждена сдаться, предварительно обеспечив беспрепятственный отъезд Ботвелла, и была препровождена восставшими в замок Лохлевен, где 24 июля подписала отречение от престола в пользу своего сына Якова VI.
Мария бежала из заточения в Англию. Первоначально Елизавета I пообещала помощь Марии, однако она была далека от идеи военной интервенции в пользу своей конкурентки на английский престол. Мария же отказывалась отречься о своих прав на английский престол, что, безусловно, очень беспокоило Елизавету. Мария не переставала интриговать против Елизаветы I, завязав секретную переписку с европейскими державами, однако реального участия в восстаниях против английской королевы она не принимала. Тем не менее имя Марии Стюарт, законной правнучки короля Генриха VII Английского, активно использовалось заговорщиками против Елизаветы I. В 1586 г. Мария Стюарт оказалась вовлеченной в неосторожную переписку с Энтони Бабингтоном, агентом католических сил, в которой она поддержала идею заговора с целью убийства Елизаветы I. Однако заговор был раскрыт и переписка попала в руки английской королевы. Мария Стюарт предстала перед судом и была приговорена к казни. 8 февраля 1587 г. Мария Стюарт была обезглавлена в замке Фотерингей.
