В мае 1890 года поступил на службу в Демидовский дом призрения трудящихся, в качестве его действительного члена. Благодаря удачной женитьбе на Анне Александровне Лавровой — дочери русского металловеда и директора товарищества гатчинских колокольных, медеплавильных и сталелитейных заводов Лаврова смог обрести финансовую независимость. Сам Прокудин-Горский стал директором правления на предприятии своего тестя. Однако прославился он совсем в другой области — стал первым в России мастером цветной фотографии.
Есть сведения, пока ещё не подтвержденные документально, что будущий пионер цветной фотографии был учеником самого Дмитрия Менделеева. В 1897 году Прокудин-Горский начал делать доклады о технических результатах своих фотографических исследований Пятому отделу Императорского Русского Технического общества (ИРТО). В 1898 году Прокудин-Горский стал членом Пятого фотографического отдела ИРТО и выступил с сообщением «О фотографировании падающих звёзд (звёздных дождей)». Уже в то время он являлся российским авторитетом в области фотографии, ему была поручена организация курсов практической фотографии при ИРТО. В 1898 году Прокудин-Горский опубликовал первые книги из серии работ по техническим аспектам фотографии: «О печатании с негативов» и «О фотографировании ручными фотоаппаратами». В 1900 году Русское техническое общество показало чёрно-белые фотографии Прокудина-Горского на Всемирной Парижской выставке.
2 августа 1901 года в Петербурге на Большой Подьяческой открылась «фотоцинкографическая и фототехническая мастерская» Прокудина-Горского, где позднее располагалась лаборатория и редакция журнала «Фотограф-любитель», в котором Прокудин-Горский опубликовал серию технических статей о принципах воспроизведения цвета.
В 1902 году Прокудин-Горский в течение полутора месяцев обучался в фотомеханической школе в Шарлоттенбурге около Берлина. Вскоре он впервые объявил о создании цветных диапозитивов, а в 1905 году запатентовал свой сенсибилизатор, значительно превосходивший по качеству аналогичные разработки иностранных химиков. Состав нового сенсибилизатора делал бромосеребряную пластину одинаково чувствительной ко всему цветовому спектру.
Точная дата начала цветных съемок Прокудиным-Горским в Российской империи до сих пор не установлена. Наиболее вероятным является факт, что первая серия цветных снимков была сделана в ходе поездки по княжеству Финляндскому в сентябре-октябре 1903 года. В 1905 года Прокудин-Горский совершил первую большую фотопоездку по России, в ходе которой снял около 400 цветных фотографий Кавказа, Крыма и Украины. Получил золотую медаль на Международной выставке в Антверпене и медаль за «Лучшую работу» в области цветной фотографии от фотоклуба в Ницце.
