На протяжении всего романа дуэт Остапа Бендера и Ипполита Матвеевича Воробьянинова (он же Киса) занимается поиском сокровищ мадам Петуховой, которая была тёщей Ипполиту, а именно бриллиантов, спрятанных в одном из 12 стульев изящного гарнитура мастера Гамбса. Она спрятала их, остерегаясь обыска, но не решалась признаться зятю, памятуя о том, что он раньше был ужасным мотом и транжирой и уже промотал состояние её дочери.
Открывается мадам Петухова ему только перед смертью. Эту тайну узнаёт и отец Фёдор, которому она исповедовалась. Ипполит Матвеевич пускается в погоню за бриллиантами, но так как его авантюристские наклонности весьма слабы (впрочем, как и организаторские), он доверяется молодому человеку с шарфом, но без носков по имени Остап Бендер…
С этого момента их уносит в круговорот из поисков, неудач, стараний и головокружительных авантюр — от создания тайного общества до превращения захолустного городишки в шахматную столицу вселенной.
Основой сюжета романа послужил рассказ А. Конан-Дойля «Шесть Наполеонов», в котором драгоценная жемчужина спрятана внутри одного из гипсовых бюстиков Наполеона. За бюстиками охотятся двое бандитов, один из которых перерезает другому горло бритвой. После выхода книги «Двенадцать стульев» авторы получили подарок от друзей по писательскому цеху — коробку, внутри которой лежало шесть пирожных «наполеон».
По мнению краеведов, Старгород «списан» с города Старобельска Луганской области, возле которого расположены еще двое «тезок» — деревня Чмыровка и Лучанск — Луганск. Осенью 1926 Ильф и Петров побывали здесь в служебной командировке, почерпнув из местной жизни ряд деталей для будущего романа. В 2008 году здесь был установлен памятник Остапу Бендеру, беседующему с беспризорником.
Некоторые литературоведы считают, что прообразом для описанного в романе города Васюки послужил Козьмодемьянск, что оспаривается жителями расположенного выше по течению Васильсурска. В Козьмодемьянске ежегодно с 1995 проводится юмористический фестиваль «Бендериана», названный в честь Остапа Бендера.
В пользу Козьмодемьянска говорит тот факт, что расположение города точно соответствует описанию в книге. Между тем нигде в записках Ильфа и Петрова не сказано, что прототипом города Васюки был Козьмодемьянск. Старый заводской клуб, бревна, сложенные вдоль берега, обветшалые домишки — вот первые приметы населенного пункта, описанного в «12 стульях». Есть и более точные факты. Когда Остапа и Кису Воробьянинова прогнали с корабля за неудачно нарисованный плакат, Бендер прочитал о нем в туристическом справочнике 1926 года: «На правом высоком берегу Волги расположен город Васюки. Отсюда отправляются лесные материалы, смола, лыко, рогожи, а сюда привозятся предметы широкого потребления для края, отстоящего на 50 километров от железной дороги».
