. Но сначала нужно объяснить, как молекулы ДНК сортируют по размеру с помощью электрофореза.
Мы помним, что ДНК – это кислота. Кислотные свойства определяются остатками фосфорной кислоты в ее составе – фосфатами. Из школьного курса известно, что анионы кислоты заряжены отрицательно: H>3PO>4 → H>+ + H>2PO>4>– . Поэтому, если через раствор, содержащий ДНК, пропустить ток, молекулы ДНК направятся к положительно заряженному электроду. А если раствор заменить гелем – несъедобным желе, молекулярной сеткой, заполненной жидкостью? Тогда молекулы ДНК не поплывут к плюсу туманным облачком, а каждая станет продвигаться со своей скоростью – чем длиннее молекула, тем труднее ей будет просачиваться через ячейки геля. Если же сделать в геле углубления (лунки) у отрицательного электрода, поместить в них ДНК и включить ток, от минуса к плюсу протянутся дорожки, и в них будут полоски, в каждой – молекулы ДНК определенного размера. Это называется “электрофорез ДНК”, или просто форез.
Теперь можем рассказать, как работает метод Сенгера. Реакционную смесь делят на четыре части. В каждую из четырех добавляют праймер (затравку для синтеза) – короткую молекулу ДНК, комплементарную началу участка, который нужно секвенировать. Праймер связывается с этим участком, образуя с ним двойную спираль. (Исследуемую ДНК перед этим, конечно, надо “расплести”, сделать однонитевой.) Фермент ДНК-полимераза, используя анализируемую ДНК в качестве матрицы, начинает наращивать праймер, соединяя в цепочку нуклеотиды. К обычным нуклеотидам в реакционной смеси добавлены необычные. Во-первых, некоторые нуклеотиды содержат радиоактивную метку (потом объясню зачем). Во-вторых, в каждой из четырех смесей небольшое количество одного из четырех нуклеотидов модифицировано – лишено OH-группы. К такому нуклеотиду (дидезоксинуклеотиду) нельзя присоединить следующий. А количество подобрано таким образом, чтобы среди новых цепочек были оборванные на каждом аденине – в одной пробирке, тимине – в другой, гуанине – в третьей, на каждом цитозине – в четвертой. И если потом внести реакционные смеси в лунки и провести электрофорез, получатся “лесенки”. Сложно, но станет яснее, если посмотреть на рис. 5 и 6.
Автоматическое распознавание
Как это происходило на практике? О-о… Классическое секвенирование по Сенгеру – процедура, которая у старшего поколения ассоциируется с золотым веком молекулярной биологии, когда было мало простого, покупного и готового и все умели работать руками, не то что сейчас. Не удержусь и расскажу подробнее: я ее еще застала.
