Приобретя духовный опыт в борьбе с диаволом, преподобный задумал уйти в глубь Фиваидской пустыни и в полном уединении служить Господу трудом и молитвой. Он просил старца-подвижника (к которому обращался в начале своего иноческого пути) удалиться вместе с ним в пустыню, но старец, благословив преподобного на новый, до тех пор неизвестный вид подвига — отшельничество, по старческой немощи не решился ему сопутствовать. Преподобный Антоний ушел в пустыню один. Диавол пытался остановить его, бросая перед преподобным драгоценности и золото, но святой, не обращая на них внимания, прошел мимо. Дойдя до одной горы, преподобный увидел какое-то заброшенное огороженное строение и поселился в нем, заложив камнями вход. Тот же верный друг приносил ему дважды в год хлеб, а вода имелась внутри ограды. В полном молчании принимал преподобный приносимую пищу.
В полном уединении и непрестанной борьбе с бесами преподобный Антоний прожил 20 лет и обрел наконец спокойствие духа и мир в помыслах. Когда настало время, Господь открыл людям Своего великого подвижника. Преподобному предстояло наставить многих мирян и монахов и руководить иноками. Собравшиеся к ограде преподобного люди разобрали заграждавшие вход камни, проникли к святому Антонию и просили взять их под свое руководство. Вскоре гора, на которой подвизался святой Антоний, была окружена целым поясом монастырских обителей, и преподобный с любовью наставлял насельников, уча духовной жизни тех, кто пришел в пустыню спасаться. Он учил прежде всего постоянству в принятом на себя подвиге, неослабному стремлению угодить Господу, щедрому и бескорыстному отношению к трудам, понесенным ранее. Он убеждал не страшиться бесовских нападений и прогонять врага силой Животворящего Креста Господня.
В 311 году Церковь постигло испытание — жестокое гонение на христиан, воздвигнутое императором Максимианом. Желая пострадать вместе со святыми мучениками, преподобный Антоний покинул пустыню и пришел в Александрию. Он открыто служил мученикам в их заточении, присутствовал на суде и допросах, но мучители к нему даже не прикоснулись! Господу угодно было сохранить его на пользу христианам. По окончании гонения преподобный вернулся в пустыню и продолжал подвиги. Господь даровал Своему избраннику дар чудотворений: преподобный изгонял бесов и исцелял больных силой своей молитвы. Множество приходящих к нему людей препятствовало его уединению, и преподобный ушел еще дальше, в так называемую «внутреннюю пустыню», и поселился на вершине горы. Однако братия из пустынных монастырей разыскали преподобного и умолили его хоть изредка посещать их обители.
