У Михаила Ивановича было два сына: Николай Михайлович, дед нашего героя, и Сергей Михайлович (?–1847). Егор Сергеевич, внук Михаила Ивановича (1820–?), лесничий, был автором книги охотничьих рассказов «Поездка в Карачаевские болота» (1867).
Отец Сергея Михайловича, Михаил Николаевич (1834/35?–1896), служил в Тифлисском гренадерском полку, вышел в отставку в чине подпоручика, затем работал в канцелярии Владимирского дворянского депутатского собрания, дворянским заседателем в Ковровской опеке, в начале 1870-х гг. – агентом Ярославско-Костромского земельного банка в Муроме, позже – почетным блюстителем Мытного двухклассного министерского училища в Гороховецком уезде, сверхштатным чиновником канцелярии Совета Императорского человеколюбивого общества. У Сергея были младшие сестра и два брата: Мария Михайловна (1869/70?—?), Александр Михайлович (ок. 1872–?) и Владимир Михайлович (1879–1960); Алексей Михайлович (род. в 1875 г.) умер во младенчестве.
Мать Сергея Михайловича Мария Николаевна (ок. 1846–1909, Гатчина), в девичестве Бардакова (Горяинова?), с 1882 г. была владелицей «Михайловской мануфактуры», занималась благотворительностью.
Прокудин-Горский три года воспитывался в Александровском лицее в Петербурге (документально не подтверждено). Не окончив, в 1886–1888 гг. слушал лекции на физико-математическом факультете Санкт-Петербургского университета. К этому времени относится его знакомство с Дмитрием Ивановичем Менделеевым, заведовавшим там лабораторией, и, вероятно, учеба у последнего. В написанных в 1922 г. автобиографических записках Сергей Михайлович упоминал о полете Менделеева на воздушном шаре для наблюдения солнечного затмения (1887); о существовании записок известно, однако тексты их утеряны.
Одной из научных проблем, которыми занимался великий химик, был ортохроматизм – учение о правильной передаче оттенков цвета в черно-белой фотографии. То же войдет в сферу интересов Прокудина-Горского, спустя немного времени увлекшегося фотографией. Но в 1888 г., оставив занятия в университете, он стал слушателем Императорской Военно-медицинской академии, которую также не окончил. Кроме того, занимался живописью в Императорской академии художеств и увлекался игрой на скрипке.
В 1890 г. Сергей Михайлович поступил на службу в Демидовский дом призрения, социально-учебное заведение для девочек из бедных семей, позже преобразованное в Женское коммерческое училище, первое в России. Отец в то время был в Демидовском доме почетным членом. Делая карьеру государственного служащего, Сергей Михайлович в 1903 г. получил чин титулярного советника.
