В период между двумя мировыми войнами университету пришлось вести жестокую борьбу за независимость с правительством буржуазной Польши. Но самые черные дни наступили в годы гитлеровской оккупации, когда фашисты начали систематически истреблять завоевания польской науки и культуры. Сразу после вступления немцев в Краков, 6 ноября 1939 года, гитлеровцы собрали в новом здании университета, Collegium Novum, профессоров, доцентов и ассистентов – всего сто восемьдесят три человека – под предлогом ознакомления с новой программой. Собравшихся ученых гитлеровцы, предварительно зверски избив, арестовали и отправили в концлагерь в Заксенхаузен под Берлином. Лишь немногим удалось пережить эти страшные годы – остальные погибли. Уничтожив весь цвет краковской научной интеллигенции, гитлеровцы со свойственной им методичностью принялись за разрушение научных лабораторий, институтов, библиотек, собраний. Наиболее ценные материалы и аппаратура были вывезены в Германию. И все же немцам не удалось сломить вольнолюбивый дух краковских профессоров и студентов – «жаков», как их по традиции продолжают называть по сей день. Оставшиеся на свободе ученые организуют подпольные лаборатории, продолжают научно-исследовательскую работу. Во главе подпольного университета встал крупный ботаник профессор Владислав Шафер. В работе университета в эти годы принимали участие сто тридцать шесть ученых разных специальностей, под руководством которых обучалось восемьсот студентов.
После окончания войны народная Польша предоставила университету все условия для дальнейшего плодотворного труда и развития. Некоторые факультеты, в том числе медицинский и сельскохозяйственный, были преобразованы в самостоятельные институты, независимые от университета, хотя и связанные с ним традициями. Зато в самом университете увеличилось число кафедр, расширились остальные факультеты. В 1959-1964 годах на аллее Трех Поэтов были построены огромные здания, оборудованные новейшей аппаратурой, для занятий студентов факультетов физики, химии, математики и биологии. Здесь же было построено здание гуманитарного факультета. Расширена и знаменитая Ягеллонская библиотека, обладающая самым обширным книгохранилищем в Польше. Под Краковом на территории бывшего форта сооружена Обсерватория имени Коперника. Новые помещения и оборудование получил Ботанический сад университета, основанный еще в XVIII веке Гуго Коллонтаем. И, разумеется, продолжает работу университетская типография – старейшая типография Польши.
