Во время венчания Бориса на царство (3 сентября) он и патриарх обменялись речами. Борис, изложив кратко историю своего избрания, просил патриарха благословить, и помазать, и поставить, и венчать его на царство по древнему царскому чину. Патриарх, повторив другими словами ту же историю, отвечал Борису, что вот ныне он благодатию Пресвятого Духа помазуется от Бога, и поставляется, и венчается на Русское государство, и выражал помазуемому царю свои благожелания. Когда спустя два года по воцарении своем Годунов сделался крайне подозрительным и начал принимать всякие доносы и наветы на своих вельмож и бояр и подвергать их страшным преследованиям и когда многие, обращаясь к Иову, говорили ему: "Что отче святый, новотворимое сие видеши, а молчиши?" - тогда он, по свидетельству его биографа, терзался совестию и сердцем, но не мог ничего сделать, так как царь Борис был строптив и не хотел видеть обличника себе. Святейший только "день и нощь со слезами непрестанно в молитвах предстоял в церкви и в келье своей, непрестанно пел молебные пения собором с плачем и великим рыданием, также и народ с плачем молил, дабы престали от всякого зла дела, паче же от доводов и ябедничества, и бе ему непрестанные слезы и плач непостижимый".
Когда настало для Бориса тяжкое время, когда явился Лжедимитрий, патриарх употреблял с своей стороны все меры, чтобы поддержать власть законного государя. Димитрий прежде всего нашел себе покровителей в Польше, и Иов вместе с прочими архиереями писал (1604) к высшей раде Короны Польской и великого княжества Литовского, к арцибискупам, бискупам и всему духовенству, и удостоверял их в своей грамоте, что выдающий себя за царевича Димитрия - обманщик, бывший монах, диакон Григорий Отрепьев, и просил ему не верить; писал также к знаменитому воеводе киевскому князю Константину (Василию) Острожскому, лично знавшему Отрепьева, и во имя православия убеждал князя обличить обманщика и схватить, хотя обе эти грамоты не достигли своей цели. Из Польши самозванец с небольшою ратью вступил в пределы России, против него послано было царское войско; патриарх в это время пел в Москве молебны о даровании победы царю Борису, убеждал народ твердо помнить данную им присягу государю, с клятвою удостоверял всех, что царевич Димитрий углицкий давно скончался и погребен, что под его именем идет теперь на землю Русскую не кто другой, как известный ему вор, расстрига Гришка Отрепьев, рассылал об этом грамоты по всей Москве, писал в полки к боярам, воеводам, дворянам и ко всей рати и, наконец, в генваре 1605 г. разослал и сам непосредственно и чрез епархиальных архиереев грамоты по всей России. В грамотах патриарх извещал, что литовский король Сигизмунд преступил крестное целование и, признав беглого чернеца расстригу Гришку Отрепьева князем Димитрием углицким, отпустил с ним своих воевод и воинов в Русскую землю, желая в ней церкви Божии разорить, костелы латинские и лютеранские поставить, веру христианскую попрать и православных христиан в латинскую и люторскую ересь привести и погубить. Затем, описав довольно подробно похождения Лжедимитрия и сказав, что он сам уже уклонился в ересь и имеет намерение поругаться в России православной вере и устроить костелы латинские и люторские, патриарх давал приказ духовным лицам прочитать эту грамоту по всем церквам, ежедневно петь молебны, чтобы Бог не попустил литовским людям превратить Русскую землю в латинскую ересь и даровал победу царю Борису над самозванцем, и всенародно проклинать не только самого самозванца, изменника, еретика, отметника веры христианской, но и всех воровских его советников и государевых изменников, которые тому вору последуют, как преданы они уже вечному проклятию в Москве всем освященным Собором.
